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    公开号:WO1980000573A1
    申请号:PCT/DE1979/000100
    申请日:1979-08-31
    公开日:1980-04-03
    发明作者:H Augustiniak；W Trowitzsch；G Reifenstahl；H Reichenbach；B Kunze；H Irschik；V Wray；L Grotjahn；K Gerth；T Kemmer
    申请人:Biotechnolog Forschung Gmbh；H Augustiniak；W Trowitzsch；G Reifenstahl；H Reichenbach；B Kunze；H Irschik；V Wray；L Grotjahn；K Gerth；T Kemmer；
    IPC主号:C12R1-00
    专利说明:
    [0001] Stoffe der empirischen Summenformel C25H33N3O3S2
    [0002] Die Erfindung betrifft einen wirkstoffhaltigen Extrakt, ein Verfahren zur Weiterverarbeitung dieses Extrakts zu neuen Stoffen der empirischen Summenformel C25H33N3O3S2, diese Stoffe und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
    [0003] Die erfindungsgemäßen neuen Stoffe werden durch einen Stamm des Bacteriums Myxococcus fulvus der Klasse Flexibacteriae, der Ordnung Myxobacterales und der Familie Myxococcaceae produziert. Der Stamm wurde 1971 aus einer Bodenprobe von Borobudur/Java isoliert. Er wurde am 22. August 1978 unter der Bezeichnung DSM 1368 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen/Göttingen hinterlegt.
    [0004] Die vegetativen Zellen des Stamms sind schlanke Stäbchen. (3,5 bis 6 μm lang und 0,8 μm dick) mit leicht verjungten Enden. Auf geeigneten Nährböden, z.B. Wasser-agar-Ausstrichen von Escherichia coli, bildet der Organismus rotbraune, tropfenförmige , weichschleimige Fruchtkörper von etwa 200 nm Durchmesser. In diesen Fruchtkörpern befinden sich kugelige , unter dem Phaaen kontrastmikroskop stark lichtbrechende Myxosporen mit einem Durchmesser von 1 ,2 bis 1 ,5 μn. Das Bacterium bewegt sich gleitend fort. Die Kolonien oder Schwärme breiten sich deshalb allmählich über die Kulturplatten aus. Gehalt an Guanin + Cytosin der DNS: 70,4 Mol% Guanin + Cytosin (Tm = Schmelztemperatur), 69,5 Mol% Guanin + Cytosin (UZ = Ultrazentrifuge; vgl. Behrens, Flossdorf & Reichenbach, Int. J. Syst. Bacteriol., 26 (1976) 561-562. Der Organismus läßt sich unter submersen aeroben Bedingungen in einem C, N und S sowie Mineralsalze enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei 15 bis 40, vorzugsweise 25 bis 35, insbesondere ca. 30° C kultivieren. Der Organismus wächst gut auf Peptonagar, z.B. - cy-Agar: 0,3 % eines pankreatisch verdauten Kaseins (Pepton) (Difco/Detroit); 0,1 % Bäckerhefeextrakt (Difco); 0,1 % CaCl2.2 H2O; 1 ,5 % Agar; oder
    [0005] - vy/2-Agar: 0,5 % (bezogen auf Frischgewicht) Bäckerhefe; 0,1 % CaCl2.2 H2O; 1 ,5 % Agar; pH 7,2. In Flüssigmedien wächst der Stamm in homogener Suspension sowohl in Schüttelkolben (etwa 150 Umdrehungen/min) als auch in Fermentern(bis zu 200 1 getestet). Als Medium eignet sich
    [0006] - eine Peptonlösung: 1 % tryptisches Pepton aus Kasein (Merck); 0,3 % MgS04.7 H2O; pH 7,2.
    [0007] Der Stamm ist streng aerob, hat aber keine hohe O2-Zeh-rung. Die Generationszeit liegt bei etwa 7 h. Aus 101 Kultur kann man etwa 100 g Zellmasse erhalten (Feuchtgewicht = etwa 25 g Trockengewicht). Der Stamm ist auf die Verwertung von Proteinen und Peptonen eingestellt und besitzt eine Reihe von noch nicht charakterisierten Enzymen zum Abbau anderer Mikroorganismen (Bakterien und Hefen) . Der Stamm produziert mindestens drei verschiedene Bacteriocine, Fulvocine genannt. Diese werden ins Medium abgegeben und wirken nur gegen nahe verwandte Bakterien; vgl. Hirsch, Arch. Microbiol. 115 (1977) 45-49. Zellfreie Kulturlösung des Stamms zeigt antibiotische Aktivität gegen grampositive Bakterien (z.B. Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus) sowie manche Pilze (z.B. Botrytis cinerea). Der Stamm produziert mehrere chemisch verschiedenartige Antibiotika, wie verzweigte Fettsäuren, Indolderivate , wie z.B. 3-Formylindol und die erfindungsgemäßen Stoffe.
    [0008] Der Stamm kann folgendemaßen konserviert werden:
    [0009] - Einfrieren vegetativer Zellen von Platten- oder Flüssigkulturen in Peptonlösung bei - 80° C; - Trocknen von Fruchtkörpern auf Filterpapier und Lagern bei Raumtemperatur;
    [0010] - Trocknen von Myxosporen in Milch und Lagerung unter Stickstoff bei Raumtemperatur.
    [0011] In Kulturen, die sich in schlechtem Zustand befinden, werden die erfindungsgemäßen Stoffe ins Medium ausgeschieden. Kennzeichen eines schlechten Zustands sind: Die Bakterien befinden sich in der stationären Phase; alkalischer pH-Wert von etwa 8 bis 8,5; die Zellen sind mehr oder weniger undicht, so daß sie normalerweise intrazelluläre Substanzen verlieren; allmählicher Übergang zu Zell-Lyse.
    [0012] Wenn die Kulturen in gutem Zustand sind, befinden sich die erfindungsgemäßen Stoffe in den Zellen. Kennzeichen eines guten Zustands sind:
    [0013] Die Bakterien befinden sich in der logarithmischen Wachstumsphase; die Zellen sind bei balanciertem Stoff- Wechsel völlig intakt und auf Wachstum programmiert.
    [0014] Die Ausbeuten aus Zellen sind höher als aus überstand, d.h. zellfreiem Medium; außerdem sind die erfindungsgemäßen Stoffe leichter bei der Gewinnung aus Zellen zu reinigen, als wenn man von zellfreiem Medium ausgeht.
    [0015] Die Produktion' der erfindungsgemäßen Stoffe hängt mit dem Wachstum zusammen, wobei sich keine spezifische Pro duktionsphase erkennen läßt. Jedoch kann die Produktion der erfindungsgemäßen Stoffe trotz guten Wachstums abgeschwächt oder unterdrückt sein, z.B. in Gegenwart von Hefeextrakt.
    [0016] Man kann einen wirkstoffhaltigen Extrakt mit u.a. einem Gehalt an den erfindungsgemäßen Stoffen dadurch gewinnen, daß man a) Zellen von Myxococcus fulvus DSM 1368 oder b) Kulturflüssigkeit nach Abtrennung der Bakterienzellen mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt gewinnt.
    [0017] Als polare organische Lösungsmittel eignen sich bei der Arbeitsweise a) Alkohole, wie Methanol, oder Ketone, wie Aceton, oder Nitrile, wie Acetonitril oder Propionitril, und bei der Arbeitsweise gemäß a) und b) Ester, wie Methyl- oder Äthylester von Essigsäure oder Propionsäure, oder CHCl3 oder CH2Cl2.
    [0018] Die erfindungsgemäßen Stoffe besitzen die empirische
    [0019] Summenformel C25H33N3O3S2 sind in Aceton, Methanol, Essigsäureäthylester und Acetonitril löslich und besitzen Spektren mit folgenden Peaks: a) UV in Isopropanol (lambda max. (log epsilon)): 227 (4,58), 307 (3,84); b) IR in Chloroform (ny (cm-1)):
    [0020] 3540, 3490, 3415 (stark), 3340 (breit), 2980, 2950 (Schulter), 2900 (Schulter), 2850 (Schulter), 1680 (stark), 1655 (Schulter), 1625 (stark), 1590 (stark); c) Massenspektrum (bei 220° C und 12 bzw. 70 eV): M+ = m/e 487; d) 1 H-NMR(3 mg/0,4 ml CDCl3 mit 0,3 % TMS) ,
    / (ppm) (Multiplizität, Integral) :
    [0021] 7,89 (s, 1), 7,14 (s, 1), 6,63 (d, 1, A-Teil eines ABX-Systems) , 6,41 (dd, 1, B-Teil des ABX-Systems mit JAB = 15 Hz und JBχ - 7 Hz) 6,26 bis 5,60 (m, 6, davon 2 H austauschbar), 4,97 (s, 1), 4,16 (Quintett, 1), 3,96 (Quintett, 1), 3,82 (t, 1), 3,58 (s, 3), 3,35 (s, 3), 2,33 (m, 1), 1,54 (d, 3), 1,17 (d,
    [0022] 3), 1,01 (d, 6); e) 13C-NMR (15 mg/0,4 ml CDCl3 mit 0,3 % TMS), delta
    [0023] (ppm) (Multiplizität des Off-Resonanzspektrums) :
    [0024] 176.3 (s), 171,9 (s), 169,4 (s), 162,6 (s), 154,5 (s), 149,0 (s), 142,4 (d) , 132,6 (d), 131,9 (d),
    [0025] 131.4 (d), 126,6 (d) , 126,0 (d), 115,6 (d), 115,3 (d), 94,3 (d), 85,2 (d) , 56,8 (q), 55,1 (q), 41,3 (d), 39,7 (d), 31,1 (d), 22,3 (q), 20,9 (q), 14,4 (q).
    [0026] Das UV-Spektrum wird durch Zusatz von 2 n Natronlauge sowie 2 n Salzsäure nicht verändert.
    [0027] Elementaranalyse gefunden berechnet
    [0028] C (%) 61,53 61,58
    [0029] H (%) 7,09 6,82
    [0030] N (%) 7,63 8,62
    [0031] S (%) 10,84 13,12 Die empirische Summenformel folgt aus dem Massenspektro gramm und der Elementaranalyse.
    [0032] Das 1H-NMR-Spektrum wurde mit 3 mg Substanz und 0,4 ml Deuterochloroform und 0,3 % Tetramethylsilan als Interner Standard durchgeführt. Das 13C-NMR-Spektrum wurde mit 15 mg Substanz und 0,4 ml DeuteroChloroform und
    [0033] 0,3 % Tetramethylsilan als interner Standard in einem
    [0034] 5 ml-Rohr durchgeführt.
    [0035] Die erfindungsgemäßen Stoffe werden als öl gewonnen und verhalten sich wie neutrale Verbindungen.
    [0036] Die erfindungsgemäßen Stoffe lassen sich nach dem Chromatographieren unter den folgenden Bedingungen durch
    [0037] zwei Fraktionen noch näher kennzeichnen: Säule mit 800 g Kieselgel (32 bis 64 μm) , Länge 320 mm, Durchmesser 65 mm; 3 bar; 1 g Extrakt von Myxococcus fulvus-Zellen DSM 1368 in Methylenchlorid/Isopropanol (90 : 10), 5 ml/min.
    [0038] Dabei weist die schneller eluierbare Fraktion folgendes CD-Spektrum auf (Zirkulardichroismus; nm) : 300 positive Elliptizität, 255 positives Maximum, 230 teta = 0,
    [0039] 220 positives Maximum; die langsamer eluierbare Fraktion weist folgendes
    [0040] CD-Spektrum (nm) auf:
    [0041] 300 positive Elliptizität, 255 positives Maximum, 230 teta = 0, 220 negatives Maximum.
    [0042] Beide Fraktionen unterscheiden sich nicht hinsichtlich der empirischen Summenformel, der Löslichkeit in den angegebenen Lösungsmitteln und der Peaks der UV-, IR-, Massenspektren-, 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren.
    [0043] Wenn man jede der beiden angegebenen Fraktionen für sich unter den angegebenen Bedingungen chromatographiert, erhält man jeweils wiederum zwei Fraktionen, und zwar die schneller und die langsamer eluierbare Fraktion.
    [0044] Die erfindungsgemäßen Stoffe zeigen beim Plattchen-Test folgendes WirkungsSpektrum (zum Plattchen-Test vgl. z.B. Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 2. Aufl., Springer-Verlag 1974): Testorganismus Hemmung a) Pilze
    [0045] Botrytis cinerea TU 157 +
    [0046] Microsporum gypseum CBS 424.66 + Penicillium digitatum CBS 319.48 +
    [0047] Mucor hiemalis Tu +
    [0048] Geotrichum candidum CBS 187.38 +
    [0049] Polyporus spec. +
    [0050] Phycomyces blakesleeanus + Rhizoctonia solani CBS 177.44 -
    [0051] Alternaria brassicola CBS 106.41 - Gliocladium roseum -
    [0052] b) Hefen Candida albicans CBS 187.38 -
    [0053] Schizosaccharomyces pombe Tu 501 -
    [0054] c) Bakterien
    [0055] Bacillus subtilis ATCC 6051 + Staphylococcus aureus +
    [0056] Escherichia coli K 12 - Pseudomonas sp. -
    [0057] Minimale Hemmkonzentration (getestet in Flüssigkulturen mit weitgehend gereinigtem Stamm) :
    [0058] Mucor hiemalis 1 ,5 μg/ml
    [0059] Staphylococcus aureus 50 μg/ml und nur bis maximal 35 % gehemmt
    [0060] Wlrkungsmechanismus (untersucht an Sporen von Mucor hiemalis):
    [0061] Die erfindungsgemäßen Stoffe wirken fungistatisch. Sie hemmen sofort nach Zugabe (2 μg/ml) die Protein-, RNS- und Chitinsynthese, wie an dem abbrechenden Einbau spezifischer Prekursoren in die Makromoleküle abgelesen werden kann. Auch der Einbau von 14C aus Glucose bricht sofort ab. Der genaue Wirkungsort ist noch nicht be-kannt.
    [0062] Biosynthese: Wenn man Kulturen des Stammes DSM 1368 mit radioaktiven Substanzen füttert, so findet man in den gereinigten, erfindungsgemäßen Stoffen Radioaktivität aus 35S-Cystein, 14C-Isoleucin, 14C-Leucin eingebaut.
    [0063] Bei Fütterung mit 14C-Phenylalanin, 14C-Tyrosin, 14C-Mevalonat und 14C-Valin erfolgt kein Einbau.
    [0064] Nach einer ersten Verfahrensvariante lassen sich die erfindungsgemäßen Stoffe dadurch gewinnen, daß man a) aus einem Kulturmedium von Myxococcus fulvus DSM 1368 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert, c) ein unpolares organisches Lösungsmittel zugibt und ein Zweiphasen-System bildet und d) die Phase des polaren organischen Lösungsmittels chromatographiert und das Laufmittel von den erfindungsgemäßen Stoffen abtrennt.
    [0065] Als polares organisches Lösungsmittel kann man einen Alkohol, z.B. Methanol, ein Keton, z.B. Aceton, einen Ester, z.B. Methyl- oder Äthylester von Essigsäure oder Propionsäure , oder ein Nitril, z.B. Acetonitril oder Propionitril, und als unpolares organisches Lösungsmittel einen bei Raumtemperatur flüssigen aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, z.B. einen C5-20- Kohlenwasserstoff, verwenden. Man kann dabei so vorgehen, daß man a) aus dem Kulturmedium die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit Aceton oder Methanol extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt einengt, d) den eingeengten Extrakt mit Essigsäureäthylester aufnimmt und mit Methanol versetzt, e) den Niederschlag abtrennt und gegebenenfalls mehrmals mit Methanol wäscht, f) die methanolische Fraktion bzw. Fraktionen zwischen Acetonitril und einem Alkan verteilt, g) die Acetonitrilphase abtrennt, einengt und chromatographiert und h) eine Fraktion mit einem Gehalt an erfindungsgemäßen Stoffen gewinnt, von der man das Laufmittel abtrennt.
    [0066] Bei einer zweiten Verfahrensvariante kann man die erfindungsgemäßen Stoffe dadurch gewinnen, daß man a) aus dem Kulturmedium von Myxococcus fulvus DSM 1368 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt einengt und mit einem unpolaren organischen Lösungsmittel aufnimmt, d) die erhaltene Lösung mit Aktivkohle versetzt und die Aktivkohle von dem unpolaren organischen Lösungsmittel abtrennt, e) die Aktivkohle mit einem polaren organischen Lösungsmittel auswäscht und f) die erhaltene Lösung chromatographiert und das Laufmittel von den erfindungsgemäßen Stoffen abtrennt. Als polares organisches Lösungsmittel kann man dabei ein Keton, z.B. Aceton, und als unpolares organisches Lösungsmittel einen bei Raumtemperatur flüssigen aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, z.B. einen C5-20-Kohlenwasserstoff ferwenden.
    [0067] Man kann dabei so vorgehen, daß man a) aus dem Kulturmedium die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit Aceton extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt einengt, d) den eingeengten Extrakt in Chloroform aufnimmt, die gebildete wäßrige Phase verwirft und die Chloroformphase trocknet, e) die getrocknete Chloroformphase einengt, f) den Rückstand in einem Alkan aufnimmt, g) die Alkanlösung mit Aktivkohle versetzt, h) die Aktivkohle über Kieselgel von dem Alkan abfiltriert und gegebenenfalls mehrmals mit dem Alkan wäscht, i) die Aktivkohle auf dem Kieselgel mit Dichlormethan auswäscht, j) an dem Kieselgel gegebenenfalls mehrmals chromatographiert und k) eine Fraktion mit einem Gehalt an erfindungsgemäßen Stoffen gewinnt, von der man das Laufmittel abtrennt.
    [0068] Bei beiden VerfahrensVarianten kann man das Einengen bei einer Temperatur von bis zu 60° C, vorzugsweise bis zu 40° C und vorzugsweise unter reduziertem Druck vornehmen und/oder n-Pentan, n-Hexan oder n-Heptan als Alkan verwenden und/oder an Kieselgel chromatographieren.
    [0069] Sofern man bei den Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Stoffe nicht von Zellen, sondern von zell freiem Medium ausgeht, kann man das zellfreie Medium mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel extrahieren, z.B. mit einem Carbonsäureester, wie Essigsäureäthylester, und den Extrakt danach in die Stufe c) einsetzen.
    [0070] Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
    [0071] Beispiel 1. Vermehrung
    [0072] Es wurde ein 501-Fermenter (Giovanola, Manthey/Schweiz) mit einem Arbeitsvolumen von 701 verwendet. Das eingesetzte Medium enthielt 1 96 tryptisches Pepton aus Kasein (Merck), 0,3 % MgSO4.7 H2O und 0,03 % eines oberflächenaktiven Mittels (Antischaum Umlub Lb 625 von Brenntag, Mülheim/Ruhr) bei einem pH von 7,2 und Autoklavierung. Das eingesetzte Animpfvolumen betrug 71 von Schüttelkulturen (entsprechend 3 x 108 Zellen/ml). Die Temperatur betrug 30° C. Die Flüssigkeit wurde mit 500 Umdrehungen/min in einemKonvexionsstrom bewegt (Umwurf). Man belüftete bis zur 13. h mit 1 Nl/min 1 Kulturvolumen und danach mit 1 ,7 Nl/min 1 Kulturvolumen. Der pO2 fiel innerhalb von 10 h gegen 0 ab und wurde danach niedrig gehalten. Der Ausgangs-pH-Wert von 7,2 stieg während des Wachstums auf 7,5 an und wurde durch Gegentitrieren mit Essigsäure bei diesem Wert gehalten. Die Gesamtfermentationsdauer betrug 30 h. Aus den abzentrifugierten Zellen wurden 2 bis 3 mg erfindungsgemäße Stoffe pro 1 l Kultur gewonnen. Der Überstand war unter diesen Bedingungen praktisch frei von erfindungsgemäßen Stoffen. Beispiel 2
    [0073] Die mit einer DurchlaufZentrifuge vom Nährmedium des Beispiels 1 getrennte rote Zellmasse wurde mit Aceton (oder Methanol in einem Parallelversuch) bis zur Entfärbung extrahiert. Der eingeengte Extrakt wurde in wenig Essigsäureäthylester gelöst und mit Methanol versetzt. Die daraufhin ausfallenden unpolaren Substanzen wurden abgenutscht und mehrmals mit Methanol gewaschen. Die eingeengte methanolische Lösung wurde nun zwischen Acetonitril und n-Heptan verteilt, wobei die restlichen unpolaren Substanzen in die Alkanphase übergingen. Danach wurde die Acetonitrilphase eingeengt. Sie enthielt die erfindungsgemäßen Stoffe.
    [0074] Zur Reindarstellung wurde über eine Kieselgelsäule mit einer Länge von 320 mm und einem Durchmesser von 65 mm mit einer Dosierpumpe bei 3 bar chromatographiert, wobei die Kieselgelsäule 800 g Kieselgel einer Teilchengroße von 32 bis 64 um enthielt (Riedel de Haen). Dazu wurde 1g eingeengter Zellextrakt im Laufmittel Methylenchlorid/lsopropanol (10 : 1; nachdestillierte pa Lösungsmittel von Merck/Darmstadt) mit einer Durchflußrate von 5 ml/min chromatographiert. Mit einem selbstregi-strierenden Durchfluß-UV-Spektrographen (bei 254 nm) wurden die erfindungsgemäßen Stoffe nach 2,5 h im Auslauf ermittelt. Es erschienen zwei Fraktionen, die mit einer Retentionszeitdifferenz von 20 min eluiert wurden. Die eingeengten Fraktionen erhielten zusammen 15 mg Sub-stanz. In der folgenden Zusammenstellung sind die RF-Wer- te der erfindungsgemäßen Stoffe in verschiedenen Laufmittelsystemen angegeben. Die Werte gelten für Dün-n-schichtchromatographie-Alufolien mit Kieselgel einer. Schichtdicke von 0,2 mm (60 F254 Merck/Darmstadt).
    [0075] RF-Werte der erfindungsgemäßen Stoffe in verschiedenen Laufmitteln (Kammern mit Laufmittel gesättigt, Laufhöhe 10 cm) RF-Werte Laufmittelsystem
    [0076] 0,26 Dichlormethan/lsopropanol
    [0077] (95 : 5) 0,29 Essigsäureäthylester 0,32 Toluol/Dioxan/Eisessig
    [0078] (30 : 10 : 1)
    [0079] Die sehr stark Fluoreszenz löschenden Flecke der erfindungsgemäßen Stoffe lassen sich durch Ansprühen mit Molybdatophosphorsäure und anschließendes Erhitzen auf 150° C schwach sichtbar machen. Ebenfalls schwach reagieren die erfindungsgemäßen Stoffe mit Benzidin nach vorgehender Behandlung mit Chlor. Die Jodazid-Stärke-Reaktion ist positiv.
    [0080] Beispiel 3
    [0081] Der Inhalt eines 81-Fermenters wurde folgendermaßen aufgearbeitet. Die vom Nährmedium abzentrifugierten Zel- len wurden bis zur Entfärbung mit etwa 21 Aceton extrahiert. Der Acetonextrakt wurde im Wasserstrahlvakuum bei etwa 40° C so weit eingeengt, bis sich Carotinoide und andere Substanzen am Kolbenrand abzusetzen begannen. Zur Abtrennung von Wasser wurde nunmehr in etwa 500 ml Chloroform aufgenommen, die Wasserphase im Scheidetrichter abgetrennt und die Chloroformphase über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde erneut im Rotationsverdampfer bei etwa 40° C abdestilliert; der Rückstand wurde in etwa 200 ml n-Heptan aufgenommen; in Parallelversuchen wurden n-Pentan und n-Hexan verwendet. Die n-Alkanphase wurde nun mit so viel Aktivkohle (2186 zur Analyse, Merck) versetzt, daß die vorher rötlich gefärbte Lösung farblos bis blaß gelbgrünlich aussah. Danach wurde die Aktivkohle über einer Kieselgelsäule (Höhe 50 mm, Durchmesser 15 mm) von der überstehenden Lösung abfiltriert. Man wusch noch dreimal mit 50 ml-Portionen des verwendeten n-Alkans. Die Filtration ließ sich beschleunigen, wenn man einen Überdruck auf die
    [0082] Säule anlegte. Danach wurden die erfindungsgemäßen Stoffe mit etwa 50 ml Dichloπnethan aus der Aktivkohle auf das Kieselgel gewaschen. Anschließend wurde nochmals Dichlormethan verwendet, bis das Kieselgel von sämtlichen gelben Zonen entfärbt war (Chromatographie). Auf diese Weise wurden alle unpolareren Stoffe als die erfindungsgemäßen Stoffe herausgewaschen, da die Stoffe gemäß der Erfindung bei dieser Polarität auf Kieselgel festgehalten werden und nicht wandern. Anschließend wurde Dichlormethan/i-Propanol (95 : 5) auf die Säule aufgegeben, so daß eine gelbbräunliche Zone mit einem Gehalt an den erfindungsgemäßen Stoffen wanderte. (Wenn zuvor zu wenig Aktivkohle verwendet wurde, war diese Zone infolge eines Gehalts an Carotinoiden rotbräunlich gefärbt.) Nach Einengen der gefärbten Zone erhielt man 400 mg Rohprodukt, das etwa 25 mg der erfindungsgemäßen Stoffe enthielt.
    [0083] Das Rohprodukt ließ sich gemäß Beispiel 2 feinreinigen.
    [0084] Allgemein läßt sich sagen, daß sich die erfindungsgemäßen Stoffe mit der Fluoreszenz löschenden Bande bei 254 nm identifizieren lassen. Damit läßt sich die Wirksamkeit von Maßnahmen zur Gewinnung dieser Stoffe ohne weiteres beurteilen. Chemische Charakterisierung von AB-Mx f!6-1: AB-1 wird als 01 gewonnen und läßt sich nicht kristallisieren. AB-1 verhält sich wie eine neutrale Verbindung.
    [0085] UV-Spektren: max(log£) 227(4.58), 307(3.84) (Isopropanol) Zusatz von 2N NaOH, sowie von 2N HCl verursachen keine Veränderung des Spektrums.
    [0086] IR-Spektrum
    K(cm-1) 3540,3490,3415(stark),3340(breit),2980,2950,
    [0087] 2900,2850,1680(stark) ,1655,1625(stark) ,1590 (stark) in CHCl3 Ermittlung der Summenformel von AB-1:
    [0088] Massenspektroskopische Bestimmung: (MS 9)
    [0089] Normal aufgelöstes Spektrum bei 220°C und 70 eV:
    [0090] M = m/e 487 (14.3 %); Basis-Peak : m/e 359 (100 %)
    [0091] Normal aufgelöstes Massenspektrum bei 220°C und 12 eV: M+= m/e 487 (100 %), Fragment-Ion m/e 359 (33.3 %).
    [0092] Hochaufgelöstes Massenspektrum des Molekül -Ions bei m/e 487 : gefunden : 487,1982 d berechnet: 487,1980 d für Summenformel C25H33N3O3S2
    [0093] Hochauflösung des Fragment-Ions bei m/e 359 : gefunden : 359,1265 d + berechnet: 359 ,1264 d für C19H23N2OS2 (= M- C6H10NO2)
    [0094] Isotopenmuster des Molekül-Ions : gefunden : 487 (100%), 488(31.4%), 489 (14.2%), 490 (3.7%) berechnet: 487 (100%), 488(31,3%), 489 (14.2%), 490 (3.4%7 für M+ AB-1 besitzt die Summenformel C25H33N3O3S2 .
    [0095] NMR-Untersuchungen an AB-1 und Derivaten von AB-1:
    [0096] Die NMR-Daten für AB-1 wurden mit einem Varian XL-100-12 Spektrometer mittels Fourier-Transformations-Technik bei 100.06 MHz für 1H und 25.16 MHz für13C-Spektren bei Raumtemperatur erhalten.Das
    [0097] Gerät war auf die Deuterium-Resonanz (15.40MHz) des Lösungsmittels gelockt und kontrolliert mit einem Varian 620-L Rechner. Alle homo und heteronuklearen Experimente sind mit dem Gyrocode® Modul des
    [0098] Gerätes ausgeführt worden.Die chemischen Verschiebungen sind relativ zu Tetramethylsilan in -Werten angegeben. Ergebnisse der NMR-Untersuchungen:
    [0099] Die H-NMR Daten für AB-1 sind in Tabelle 2 gezeigt. Homonukleare
    [0100] Doppelstrahl-Experimente und Spektren-Analyse erlauben die Zuordnung zu den Partial Strukturen in Fig.l.
    [0101] Die Analysen zeigen, daß die Protonen der Doppelbindungen trans-orientiert sind. Es wurden Protonen-entkoppelte und proton Single frequency off-resonance decoupled (SFORD) 13C-Spektren erhalten. Von AB-1 konnte auch ein 13C-Protonen-gekoppeltes Spektrum aufgenommen werden,zu dem an - schließend zahlreiche selektive Protonen Dekopplungs-Experimente ausgemführt wurden. Damit gelang die Kreuz-Korrelation zwischen den 1H- und
    [0102] 13 C -NMR Verschiebungen. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 aufgelistet.
    [0103] Integration des 1H-NMR-Spektrums, Multiplizität der C-Atom-Signale im SFORD-Spektrum und die Anzahl der Signale im 13C-Spektrum stimmen mit der Molekularformel aus dem hochaufgelöstem Massenspektrum von AB-1 überein.
    [0104] Die selektiven Protonen-entkoppelten 13C-Spektren führten zu der Partial -
    [0105] Struktur des aromatischen Teiles von AB-1, die in Fig. 2 wiedergegeben ist.
    [0106] Die Werte der Kopplungskonstanten sind, verglichen mit denen vom Thiazol , von richtiger Größenordnung(Tabelle 4). Für die Konstitution von AB-1 wird daher die Strukturformel in Fig. 3 angenommen.
    [0107] Weitere Absicherung der Strukturaufklärung durch chemische Modifikation und oxidativen Abbau:
    [0108] Einwirkung von methanolischer 1N Salzsäure über Nacht auf AB-1 liefert eine Verbindung, die nach Hochauflösung des Molekül-Ions die Summenformel
    [0109] C24H31N3O3S2 besitzt und wegen des fehlenden Methyl -Signals im 1H-NMR-Spektrum bei 3.576 ppm als Demethyl-AB-1 bezeichnet wird. NMR-Vergleich mit AB-1 zeigt, daß der Verlust des Methyl -Signals im 1H-NMR-Spektrum einhergeht mit dem Auftreten einer CH2-Gruppe mit einem Signal bei 3.56 ppm, deren Protonen nach Schütteln mit D20 gegen Deuterium ausgetauscht werden. Der Verlust des Singuletts bei 4.94 ppm, das dem Methin-Proton des Enolethers zugeordnet wird,korrespondiert mit dem Verlust des entsprechenden13 C-Signals bei 94.32 ppm und dem Auftreten eines Signals bei 207.92 ppm, eines gesättigten Carbonyl-C-Atoms. Die Tabellen 5 und 6 zeigen die ehe - mischen Verschiebungen der 1H- bzw.13C-NMR-Spektren von Demethyl-AB-1.
    [0110] In Fig.4 ist die Partialstruktur von Demethyl-AB-1 abgebildet. Katalytische Reduktion von AB-1 für 3 h mit Pd/BaS04 bei 2.5 atm H2 liefert..ein Produkt, das nach massenspektroskopischer Hochauflösung die Summenformel C25H39N3O3S2 aufweist, also gegenüber AB-1 sechs Wasserstoff-Atome mehr aufweist. Das 1H-NMR Spektrum (Tabelle 7, H2-AB-1 zeigt die Enol-Ether Funktion unverändert. Im Massenspektrum tritt auch das dem Enol-Ether zugeordnete Fragment -Ion=M+-C6H10N02 auf. Damit ist klar, daß die Enol-Ether-Funktion unter den angegebenen Bedingungen nicht reduziert worden ist.
    [0111] Ozonolyse bei -80°C in Methanol lieferte nach oxidativer Aufarbeitung mit Ameisensäure und H202 eine UV-aktive Substanz, die durch chroma - tographisehe Reinigung an Kieselgel kristallin gewonnen werden konnte. Das hochaufgelöste Massenspektrum zeigte eine Summenformel von C10H8N2O3S2 an. Interpretation der Spektren führte zu der in Fig.5 angegebenen Struktur des Saramycetinsäuremethylester. In einer Un - abhängigen Synthese nach dem Schema in Fig.6 konnte der bisher nicht synthetisierte Ester ebenfalls kristallin erhalten werden. Er war in den spektroskopischen und chromatographischen Eigenschaften identisch mit dem aus der Ozonolyse von AB-1 erhaltenen Ester. Die H-NMR Daten sind in Tabelle 8 wiedergegeben.
    [0112] Anmerkung: AB-Mx f16-1 = AB-1 - erfindungsgemaßer Stoff der
    [0113] Bummenformel C25H33N3O3S2
    [0114] T
    [0115]
    [0116] Fußnoten:
    [0117] 1) Aus Spektren-Analysen
    [0118] 2) sp=Septett, q= Quartett, d=dublett und s=Singulett
    [0119] 3) Aus einem 270 MHz-Spektrum.
    [0120] 4) Einstrahlen bewirkt Verschärfung der Resonanzlinie bei 3.576 ppm
    [0121] Fußnoten:
    [0122] 1) Symbole wie in Tabelle 2 und quin=Quintett, m= Multiplett und (1/2 Zahl)= Peak-Breite in Hz bei halber Höhe des Signals
    [0123] 2) Korrelation zwischen 13C-Verschiebungen und direkt gebundenen H-Atomen
    [0124] 3) Die Reihenfolge dieser Signale ist auch bestimmt durch die Off-Resonanz
    [0125] Effekte der selektiven Dekopplungs-Experimente.


    [0126] Fußnote:
    [0127] 1) Die 13 C chemischen Verschiebungen sind durch Kreuz- Korrelation mit dem
    [0128] H-NMR Spektrum zugeordnet worden.
    [0129] l3
    [0130]
    [0131] Fußnoten:
    [0132] 1) Die Kopplungsmuster sind ähnlich wie in AB-1
    [0133] 2) Siehe Fußnote 2) in Tabelle 2
    [0134] T
    [0135]
    [0136] Fußnoten:
    [0137] 1) Siehe Fußnote 1) Tabel le 3
    [0138] 2) Nach Schütteln mit D2O verschwindet dieses Signal
    [0139]
    [0140]
    [0141]
    [0142]
    [0143]
    权利要求:
    Claims

    Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines wirkstoffhaltigen Extrakts, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man a) Zellen von Myxococcus fulvus DSM 1368 oder b) Kulturflüssigkeit nach Abtrennung der Zellen von Myxococcus fulvus DSM 1368 mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt gewinnt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man als polares organisches Lösungsmittel gemäss Anspruch 1 a) einen Alkohol, z. B. Methanol, ein Keton, z. B. Aceton, oder ein Nitril, z. B. Acetonitril oder Propionitril, und gemäss Anspruch 1 a) oder b) einen Ester, z. B. Methyl- oder Äthylester von Essigsäure oder Propionsäure, oder Chloroform oder Dichlormethan verwendet.
    3. Stoff der empirischen Summenformel C25H33N3O3S2, der in Aceton, Methanol, Essigsäureäthylester, Acetonitril, CHC13 und CH2Cl2 löslich und in Wasser wenig löslich ist, und mit folgenden Spektrenpeaks : <Desc/Clms Page number 30>.a) UV in Isopropanol (lambda max. (log epsilon)): 227 (4,58), 307 (3,84); b) IR in Chloroform (ny (cm-1)):3540, 3490, 3415 (stark), 3340 (breit), 2980,2950 (Schulter), 2900 (Schulter), 2850 (Schulter), 1680 (stark), 1655 (Schulter), 1625 (stark), 1590 (stark); c) Massenspektrum (bei 220 C und 12 bzw. 70 eV):M+ = m/e 487 ;
    d) H-NMR (3 mg/0,4 ml CDCl3 mit 0,3 % TMS), # (ppm) (Multiplizität, Integral):7,89 (s, 1), 7,14 (s, 1), 6,63 (d, 1, A-Teil einesABX-Systems), 6,41 (dd, 1, B-Teil des ABX-Systems mitJAB = 15 Hz und JBX = 7 Hz), 6,26 bis 5,60 (m, 6, davon 2 H austauschbar), 4,97 (s, 1), 4,16 (Quintettl), 3,96 (Quintett, 1), 3,82 (t, 1), 3,58 (s, 3), 3,35 (s, 3), 2,33 (m, 1), 1,54 (d, 3), 1,17 (d, 3), 1,01 (d, 6);
    e) 13C-NMR (15 mg/0,4 ml CDC13 mit 0,3 % TMS), delta (ppm) (Multiplizität des Off-Resonanzspektrums):176,3 (s), 171,9 (s), 169,4 (s), 162,6 (s), 154,5 (s), 149,0 (s), 142,4 (d), 132,6 (d), 131,9 (d), 131,4 (d), 126,6 (d), 126,0 (d), 115,6 (d), 115,3 (d), 94,3 (d), 85,2 (d), 56,8 (q), 55,1 (q), 41,3 (d), 39,7 (d), 31,1 (d), 22,3 (q), 20,9 (q), 14,4 (q).
    4. Stoff nach Anspruch 3, g e k e n n z e i c h n e t ferner durch folgendes CD-Spektrum (nm): 300 positive Elliptizität, 255 positives Maximum, 230 teta = 0, 220 positives Maximum, und durch eine schnellere Eluierbarkeit als der Stoff-. <Desc/Clms Page number 31> gemäss Anspruch 5 (Säule mit 800 g Kieselgel (32 bis 64 m), Länge 320 mm, Durchmesser 65 mm ; bar ; g Ex- trakt von Myxococcus fulvus-Zellen DSM 1368 in Methylenchlorid/Isopropanol (90 : 10), 5 ml/min).
    5. Stoff nach Anspruch 3, g e k e n n z e i c h n e t ferner durch folgendes CD-Spektrum (nm): 300 positive Elliptizität, 255 positives Maximum, 230 teta = 0, 220 negatives Maximum, und durch eine langsamere Eluierbarkeit als der Stoff gemäss Anspruch 4 (Säule mit 800 g Kieselgel (32 bis 64 um), Länge 320 mm, Durchmesser 65 mm ; bar ; g Ex- trakt von Myxococcus fulvus-Zellen DSM 1368 in Methylenchlorid/Isopropanol (90 : 10), 5 ml/min).
    6. Verfahren zur Herstellung der Stoffe gemäss Anspruch 3, 4 oder 5, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man a) aus dem Kulturmedium von Myxococcus fulvus DSM 1368 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert, c) ein unpolares organisches Lösungsmittel zugibt und ein Zwei-Phasen-System bildet und d) die Phase des polaren organischen Lösungsmittels chromatographiert und das Laufmittel von den Stoffen gemäss Anspruch 3, 4 oder 5 abtrennt.
    7. Verfahren nach Anspruch 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man als polares organisches Lösungsmittel einen Alkohol, z.B. Methanol, ein <Desc/Clms Page number 32> Keton, z. B. Aceton, einen Ester, z. B. Methyl- oder Äthylester von Essigsäure oder Propionsäure, oder ein Nitril, z. B. Acetonitril oder Propionitril, und als unpolares organisches Lösungsmittel einen bei Raumtemperatur flüssigen aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, z. B. einen C5-20-Kohlenwasserstoff, verwendet.
    / 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, d a d u r c h gekennzeichnet , dass man a) aus dem Kulturmedium gemäss Anspruch 1 oder 2 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit Aceton oder Methanol extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt einengt, d) den eingeengten Extrakt mit Essigsäureäthylester aufnimmt und mit Methanol versetzt, e) den Niederschlag abtrennt und gegebenenfalls mehrmals mit Methanol wäscht, f) die methanolische Fraktion bzw. Fraktionen zwischen Acetonitril und einem Alkan verteilt, @ g) die Acetonitrilphase abtrennt, einengt und chromatographiert und h) eine Fraktion mit einem Gehalt an einem Stoff gemäss Anspruch 3, 4 oder 5 gewinnt, von der man das Laufmittel abtrennt.
    9. Verfahren zur Herstellung der Stoffe gemäss An- spruch 3, 4 oder 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man a) aus dem Kulturmedium von Myxococcus fulvus DSM 1368 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert,. <Desc/Clms Page number 33> c) den erhaltenen Extrakt einengt und mit einem unpolaren organischen Lösungsmittel aufnimmt, d) die erhaltene Lösung mit Aktivkohle versetzt und die Aktivkohle von dem unpolaren organischen Lösungsmittel abtrennt, e) die Aktivkohle mit einem polaren organischen Lösungsmittel auswäscht und f) die erhaltene Lösung chromatographiert und das Laufmittel von den Stoffen gemäss .Anspruch 3, 4 oder 5 trennt.
    10. Verfahren nach Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n ze i c h n e t , dass man als polares organisches Lösungsmittel ein Keton, z. B. Aceton, und als unpolares organisches Lösungsmittel einen bei Raumtemperatur flüssigen aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, z.B. einen C5-20-Kohlenwasserstoff, verwendet.
    11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, d a d u r c h gekennzeichnet , dass man a) aus dem Kulturmedium gemäss Anspruch 1 oder 2 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit Aceton extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt einengt, d) den eingeengten Extrakt in Chloroform aufnimmt, die gebildete wässerige Phase verwirft und die Chloroformphase trocknet, e) die getrocknete Chloroformphase einengt, f) den Rückstand in einem Alkan aufnimmt, g) die Alkanlösung-mit Aktivkohle versetzt, h) die Aktivkohle über Kieselgel von dem Alkan abfiltriert und gegebenenfalls mehrmals mit dem Alkan wäscht, <Desc/Clms Page number 34> i) die Aktivkohle auf dem Kieselgel mit Dichlormethan auswäscht, j) an dem Kieselgel gegebenenfalls mehrmals chromatographiert und k) eine Fraktion mit einem Gehalt an einem Stoff gemäss Anspruch 3,4 oder 5 gewinnt,
    von der man das Laufmittel abtrennt.
    12. Verfahren nach Anspruch 6, 7, 8,9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass man das Einengen bei einer Temperatur von bis zu 60 C, vorzugsweise bis zu 40 C und vorzugsweise unter reduziertem Druck vornimmt und/oder n-Pentan, n-Hexan oder n-Heptan als Alkan verwendet und/oder an Kieselgel chromatographiert.
    13. Extrakt, erhalten nach dem Verfahren gemäss .
    Anspruch 1 oder 2.
    14. Verfahren zur Weiterverarbeitung des Extrakts gemäss Anspruch 13, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man den Extrakt in die Stufe c) des Verfahrens gemäss Anspruch 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 einsetzt.
    15. Verfahren zur Herstellung eines Kulturmediums mit einem Gehalt an Stoffen gemäss Anspruch 3,4 oder 5 5 , dadurch gekennzeichnet, dass man Myxococcus fulvus DSM 1368 unter submersen aeroben Bedingungen in einem C, N und S sowie Mineralsalze enthaltenden wässrigen Nährmedium bei 15 bis 40, vorzugsweise 25 bis 35, insbesondere ca. 30 C kultiviert und gegebenenfalls die Stoffe gemäss Anspruch 3,4 oder 5 . <Desc/Clms Page number 35>
    - aus dem Kulturmedium oder - aus den Zellen von Myxococcus fulvus DSM 1368 (nach deren Abtrennung vom Kulturmedium) extrahiert.
    16. Kulturmedium, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 15.
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